### 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃。培养基为DMEM，添加10% FBS和1% P/S。贴壁细胞A-673来源于一名15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂上形成克隆，并在接受免疫抑制血清处理的小鼠中形成肿瘤。此细胞株具备四个以上的标志性染色体，同时还包含一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。

### 传代方法

第一个建议的传代比例为1:2。传代操作后需在两天内更换培养液。对于细胞的购买，建议同步进行，购买时可享受品牌优惠。收到细胞后，处理至良好状态后，应填满培养液并密封瓶口，这是运输细胞的最佳方法。

收到细胞后，请使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。通过显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（最好于40x、100x、200x各拍摄一张），前三天的照片是售后服务的重要依据，若未能提供照片，则默认收到的细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

细胞传代：若细胞汇合度未超过80%，将瓶内的完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基继续培养，若细胞密度超过80%，可进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS进行1-2次洗涤。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，随后在显微镜下观察细胞状态。若细胞大部分变圆并开始脱落，迅速将其放回操作台，轻轻敲打培养瓶后添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后吸出并转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基以重新悬浮。
4. 根据1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

对于悬浮细胞的传代步骤：半换液法可以在培养箱中竖立培养瓶静置约1小时，轻轻吸走3ml左右的培养基后，补充3ml的完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接添加约500ul的FBS。传代时可直接补充5ml的培养基分成两个培养瓶，通常此方法可使用3次后进行离心传代以去除死细胞。

在离心换液法中，如需分瓶，将细胞悬液收集于离心管中以1000 RPM离心5分钟，弃去上清后，补加1-2ml培养液，重悬混匀后，将细胞悬液按1:2的比例分配至新T25瓶中，添加6-8ml全新培养基以维持细胞生长活力，后续的传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存：1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS洗涤一次；2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞收缩变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打后将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM离心5分钟；3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液，混匀后转入冻存管。4. 将冻存管直接放入-80℃冰箱，如果后续要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上才能转移。

细胞复苏：1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶后用75%酒精擦拭外壁；2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000 RPM离心5分钟；3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞在运输过程中可能会出现脱落现象，这是正常的。如果脱落较多，可以将培养瓶内所有培养液收集至离心管中进行1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养，并在后期进行对比培养，弃去沉淀后添加1-2ml胰酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后再添加5ml完全培养基终止反应。之后再次离心、弃去上清，并用1-2ml完全培养基重悬。最终按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），再添加新培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

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