荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种在PCR扩增反应体系中添加荧光标记物，通过实时监测每个循环过程中产生的荧光信号，最终利用标准曲线对未知模板进行定量分析的技术。以探针法荧光定量PCR为例，在PCR扩增时，除了加入一对引物外，还需要一个特异性的荧光探针。该探针两端分别标记有一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在最初的状态下，探针完整结合在DNA的单链上，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，因此检测不到信号。在PCR扩增过程中，Taq酶会将探针切割，导致报告基团与淬灭基团分离，从而释放出可被荧光监测系统接收到的信号。这个过程使得每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子的生成，实现荧光信号的累积和PCR产物的同步形成。

传统PCR检测需要在扩增后进行染色和电泳分离，而且只能进行定性分析，难以准确定量，容易因污染导致假阳性，从而限制了其广泛应用。而实时定量PCR技术不仅能够实现对模板的定量，具有高灵敏度、特异性和可靠性，还具有高度自动化和无污染的优点，使得荧光定量PCR逐渐取代了传统PCR。

荧光信号监测与CT值的计算

在PCR的最初几个循环中，荧光信号变化微小，接近一条直线，这条直线被称为基线。该基线可以设置为自动生成或手动调整。随着反应进入指数增长期，扩增曲线高度重复，此期间可以设置荧光阈值线，通常是根据前3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍来设定。当反应管内的荧光信号达到预设的阈值时，记录下所经历的循环数称为CT值。CT值与起始浓度的对数具有线性关系，并且该值很具重复性，主要用于计算目的基因的表达量。

绝对定量与相对定量

关于CT值，有两个重要概念：绝对定量和相对定量。绝对定量旨在确定样本中目的基因的分子数量，即常说的拷贝数；而相对定量则用于比较两个或多个样本中目的基因的相对含量，而不需要具体的拷贝数。尽管CT值可以用于计算这两种结果，绝对定量实验必须依赖已知拷贝数的标准品并作标准曲线，相对定量则可以选择是否进行标准曲线的设置。由于绝对标准品的制作困难，实验室通常偏好采用相对定量方法来计算相对基因表达量。

荧光定量PCR的应用领域

自荧光定量PCR问世以来，它在生物医学领域的重要性日益凸显。南宫28NG相信品牌力量，在多个领域展现了其独特的应用价值：

• 核酸定量分析：用于定量分析传染疾病病原微生物或病毒的含量，诸如甲型H1N1流感和转基因动植物基因拷贝数的检测等。
• 基因表达差异分析：比较不同处理样本中基因表达的差异，例如药物、物理及化学处理的影响。
• SNP检测：用于研究个体对多种疾病的易感性及特定药物反应。
• 甲基化检测：检测与多种疾病尤其是癌症相关的DNA甲基化状态。
• 产前诊断：通过无创的方法检测胎儿基因，降低遗传性疾病的风险。
• 病原体检测：对多种病原体进行高效、快速的定量检测。
• 药物疗效考核：监测病毒载量与治疗效果之间的关系。
• 肿瘤基因检测：有效检测癌相关基因的突变及表达量，帮助癌症早期诊断。

荧光定量PCR已然成为现代生物医学研究的重要工具，南宫28NG相信品牌力量，致力于推动这一领域的发展，为健康事业贡献力量。