在前两期中，我们探讨了细胞转染及慢病毒转染的基础知识。本期将继续深入探讨慢病毒转染的实验步骤、注意事项及常见问题。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒实验流程主要包括：质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞以及筛选与验证。

1. 质粒构建

首先构建重组质粒，通过将外源目的基因片段插入质粒载体中，得到重组质粒，并在大肠杆菌中转化，最终提取出重组质粒DNA。

2. 病毒包装

接下来，将重组质粒DNA与其他包装质粒按说明书要求的比例共转染293T细胞，分别在48小时和72小时收获含病毒的上清。

3. 病毒收集浓缩

将收集的病毒上清以3000rpm离心20分钟，然后通过045um滤膜过滤以去除细胞沉淀。接下来以12000rpm的速度对上清进行离心以初步浓缩，并分装后储存于-80°C。必要时可对病毒进行滴度测定。超速离心法和PEG沉淀法均有效，但前者设备要求较高，后者操作简单且成本低，但效率较低。

4. 慢病毒转染细胞

第一天：以293T细胞为例，自行消化并计数，调整细胞密度至1x10⁵个/mL，接种至24孔板，每孔0.5mL，混匀后放于37℃、5% CO₂培养箱中培养。应确保第二天进行感染时，细胞汇合度在30%-50%之间。

第二天：观察细胞生长情况，将旧培养基吸去，加入预热的新鲜完全培养液，每孔0.25mL，再放回培养箱4小时。注意操作要轻柔，避免损伤细胞。部分孔应作为对照组不加病毒。

第三天：在转染后24小时，用显微镜检查细胞状态，若无异常，吸去培养液并补加新鲜培养液。

第四至六天：观察转染效果。若转染了带荧光标记的慢病毒，转染后48小时可通过荧光显微镜检测其荧光强度，以评估转染效果，并可根据需要加入适宜浓度的puromycin等筛选药物，筛选成功转染的细胞。对于生长较慢的细胞，观察时间可延长至96小时。

二、慢病毒实验注意事项

(1) 病毒保存：短期（不超过一周）可存于4℃，长期需分装后储存于-80℃。避免反复冻融，以保持病毒活性。

(2) 细胞状态：选择在对数期生长的细胞进行转染，以提高转染效率。

(3) 细胞接种量：根据细胞增殖速度和培养器皿大小调整，一般细胞密度应保持在30%-50%。原代细胞可在接种时提高至90%左右。

(4) MOI值：MOI值越高，细胞转染的难度越大，需根据细胞计数计算病毒用量。

(5) 文献查找：实验前需查找靶细胞的培养条件、增殖速度、MOI值及药物筛选参数，以优化转染条件。

(6) 细胞状态观察：转染前后需关注细胞状态，若观察到细胞状态不佳，建议延迟药物筛选。

(7) 转染效率观察时间：一般应在转染48小时到72小时后观察，对于生长缓慢的细胞可延长观察时间。

三、实验常见问题

Q1：如何提高慢病毒对细胞的感染效率？
确保细胞状态良好及适当的细胞密度，有助于提高感染效率。此外，可针对悬浮细胞采取离心感染策略，以提高感染的成功率。

Q2：转染后细胞死亡，怎么办？
多种因素可能导致细胞死亡，需保证细胞状态良好及适宜的感染条件。

Q3：稳定转染的目的基因会整合到染色体，而瞬时转染呢？
无论是瞬时还是稳定转染，DNA都有可能整合。不同的是，稳定转染可通过药物筛选保留成功整合的细胞。

Q4：慢病毒转染时的细胞接种量应如何调整？
根据细胞增殖速度和培养器皿大小调整接种量，确保在感染后4天细胞适度生长。

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