人神经干细胞培养方法

准备神经干细胞(NSC)扩增完全培养基

1、神经干细胞(NSC)扩增培养基的制备需要补充NSC补充剂和L-丙氨酰-谷氨酰胺。

2、在无菌环境下，依次将20mL NSC补充剂和5mL 200mM L-丙氨酰-谷氨酰胺(终浓度2mM)加入480mL NSC培养基中，形成神经干细胞完全培养基。

3、（可选）在培养基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-链霉素）溶液。所有成分需在有效期限内储存于2°C至8°C的黑暗环境中，以确保稳定性可持续达4周。可选择添加200μM抗坏血酸，尤其针对悬浮培养。

包被孔板

1、基质胶包被孔板：取出6孔板或12孔板，每孔添加1mL或0.5mL即用型基质胶，轻轻晃动以确保基质胶完全覆盖皿底，放置于37°C培养箱中孵育1-2小时。孵育后将其转移至超净工作台室温平衡20分钟，如暂时不使用，可用Parafilm密封存放于2-8°C，且需在1周内使用。

2、使用前，弃去平衡后的即用型基质胶，加入预热的完全NSC培养基。

NSC传代

1、当细胞密度达到90-100%时，丢弃培养瓶中的培养基。

2、用5mL不含钙和镁的预温DPBS洗涤细胞，然后吸去溶液。

3、在每个培养瓶中加入10mL预热的人多能干细胞消化液，并在室温下孵育2-5分钟，确保细胞被完全覆盖。

4、用倒置显微镜观察细胞是否脱离，如需，可轻拍培养瓶以促进细胞脱落。

5、轻轻上下移液，分散细胞团至单个细胞悬液中。

6、添加9mL预热的NSC完全培养基，停止细胞解离反应，并将细胞悬液转移至无菌离心管中。

7、以200×g离心4分钟。

8、弃去上清，用适量NSC完全培养基重悬细胞沉淀。

9、用自动细胞计数器测定活细胞密度。

10、从每个培养瓶中去除覆盖液后，加入5mL预热的NSC完全培养基，同时添加Y27632（终浓度10μM）。

11、在每个培养瓶中添加5×104细胞/cm²（例如，125×106细胞/T-25培养瓶），然后混合以确保均匀分布。

12、在37°C、5% CO2的潮湿环境中孵育以保证最佳细胞生长。建议每2-3天更换培养基，使用新鲜的预热NSC完全培养基。

NSC冻存

1、准备干细胞冻存液。

2、按照NSC传代中的步骤1至步骤7收集细胞进行冷冻保存。

3、在离心过程中，依据需要的细胞密度为2×106个活细胞/mL计算最终体积。

4、弃去上清后用NSC完全培养基重悬细胞。

5、加入等量的冻存液以获得终浓度10%DMSO。

6、将细胞悬液均分至冻存瓶中（1mL/瓶）。

7、在控制降温速率的冷冻设备中将温度降低至-80℃，每分钟降低1°C。

8、将冷冻细胞转移至液氮中保存。

NSC复苏

1、在37°C水浴中迅速解冻细胞（<2分钟）。

2、用移液管将冻存液转移至无菌的15mL离心管中。

3、小心滴加4mL预热的NSC完全培养基，同时轻旋混合。

4、继续添加预热的NSC完全培养基至10mL。

5、以200×g离心4分钟，确认细胞沉淀并弃上清。

6、使用5mL预热的NSC完全培养基重悬细胞沉淀，并添加Y27632（终浓度10μM），最后将全部内容物转移至包被的培养瓶中。

7、在37°C、5% CO2的潮湿环境中孵育。

8、复苏后24小时内更换为新鲜预热的NSC完全培养基。建议在初始传代时以≥1×105个细胞/cm²的密度接种细胞。

脑类器官的诱导及操作流程

准备工作

1、设备需包括CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜等。

2、准备相应的试剂和耗材，包括动物脑类器官培养基、基质胶、离心管等。

诱导流程

1、加胶、点板、加液：准备冷却的基质胶，接种细胞团混合物，接种密度控制在合适范围，然后放入培养箱以成胶状态培养约10-14天。

2、类器官传代操作时，需根据类器官的数量及体积进行分组，确保其生长条件的稳定并避免细胞死亡。

冻存与复苏

1、类器官在生长期进行冻存，不需消化。确保冻存液正确混合，采用分级冻存法。

2、冻存后，快速取出解冻，添加相应的培养基进行重悬，以利于类器官恢复活性。

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